一、菌落总数的检测

1、生活饮用水(自来水)

无菌取样1毫升,营养琼脂NA倾注平板计数(菌落总数).

倾注平板:把菌悬液直接加到平板上,然后倒上温度适宜的培养基,混匀,凝固后培养,再计数.

2、水源水

无菌取样,无菌生理盐水稀释,不同浓度1毫升营养琼脂倾注计数

二、总大肠菌群的检测

总大肠菌群——一群在37摄氏度培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌.

(一)多管发酵法

乳糖发酵试验

双料乳糖蛋白胨培养液CFU其实就是TSB,计数添加TTC

单料乳糖蛋白胨培养液

无菌生理盐水

10毫升/1毫升(稀释后)水样接种到上述培养基内,36摄氏度±1培养24小时,若不产酸不产气,可报告总大肠菌群阴性；若产酸产气者,进行下一步

1、分离培养

将产酸产气的发酵管转种在伊红美兰琼脂平板上36摄氏度±1培养18～24小时,观察菌落形态,挑取符合下列特征的菌落做革兰氏染色、镜检和证实实验.

深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落.

2、证实实验

染色为阴性无芽孢杆菌,接种乳糖蛋白胨培养液

(二)滤膜法

总大肠菌群滤膜法——指用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样,将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上36±1摄氏度培养24小时,能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌以检测水中总大肠菌群的方法.

1、准备滤膜

滤膜、滤器灭菌

2、过滤水样

3、培养

用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,将平皿倒置放入37摄氏度恒温箱内培养24小时

4、结果观察

挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检:

紫红色、具有金属光泽的菌落；深红色、不带或略带金属光泽的菌落；淡红色、中心色较深的菌落

镜检为阴性无芽孢杆菌再接种乳糖蛋白胨培养液

总大肠菌群菌落数的计算

(三)酶底物法

总大肠菌群酶底物法——指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶的细菌群组,该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化,以此技术来检测水中总大肠菌群的方法.

培养基:ONPG-MUG(MMO-MUG)

1、定性反应

用100毫升的无菌稀释瓶量取100毫升水样,加入2.7g±0.5gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解后,放入36±1摄氏度培养24小时.

2、定量反应

10管法；51孔定量盘法.

3、结果判读

将水样培养24小时后进行结果判读,如果结果为可疑阳性,可延长培养时间到28h进行结果判读,超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果.

水样经24小时培养之后如果颜色变成黄色,判断为阳性反应,表示水中含有总大肠菌群；水样颜色未发生变化,判断为阴性反应,定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告.

三、耐热大肠菌群(靠温度筛选,培养基只是展示方式.)

耐热大肠菌群——用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开,在44.5摄氏度仍能生长的大肠菌群,称为耐热大肠菌群.致病性危害性更高.

(一)多管发酵法

自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管中取1滴转种于EC肉汤培养基(纯营养无指示剂)中,置44.5摄氏度培养24小时,若不产气可报告阴性,若产气,转种于伊红美兰琼脂平板上,置44.5摄氏度培养18～24小时,凡平板上有典型菌落者,则证实为耐热大肠菌群阳性.

(二)滤膜法

培养基:MFC培养基

培养方式:44.5摄氏度培养24小时(恒温水浴)

结果:耐热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色,非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色.可疑菌转种EC培养基上44.5摄氏度培养24小时

四、大肠埃希氏菌

(一)大肠埃希氏菌多管发酵法——指多管发酵法总大肠菌群阳性,在含有荧光底物的培养基上44.5摄氏度培养24小时产生β-葡萄糖醛酸酶,分解荧光底物释放出荧光产物,是培养基产生特征性荧光的细菌,以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法.

培养基:EC-MUG培养基

培养方式:44.5摄氏度培养24小时(恒温水浴)

结果:紫外灯下产荧光

(二)滤膜法_大肠杆菌只能和MUG反应_

培养基:MUG营养琼脂培养基(NA-MUG)

培养方式:36±1摄氏度培养4h

结果:紫外灯照射菌落边缘或背面有蓝色荧光表示水中含有大肠埃希氏菌

(三)酶底物法

同总大肠菌群